Czy słyszeli kiedyś Państwo o ambystomie meksykańskiej vel aksolotlu? Samo w sobie stworzenie jest przeciekawe, a w dodatku wielce użyteczne w nauce zajmującej się prostym pytaniem: jak zrobić, by odrastała nam utracona noga, albo chociaż palec? Ten nieduży płaz ogoniasty (czyli taki trochę kuzyn traszki bardziej niż żaby, a w sumie salamandra, tylko niedojrzała) żyje w jeziorach na południe od miasta Meksyk. Jest lokalnym przysmakiem i sprawia radość wielu akwarystom. Dla naukowców zaś to jedyny model pozwalający badać cuda regeneracji. Takie prawdziwe, czyli że odrastają kończyny albo i kawałek głowy.

To, czego nauczyli się od aksolotla spece od odrastania rąk, nóg, a nawet mózgu, zatrudnieni na Uniwersytecie Yale, opowiedzieli na łamach czasopisma eLife. Co jest bardzo miłe z ich strony, gdyż dzięki temu każdy może sobie za zupełną darmochę przeczytać całą eksperymentalną pracę [1].

Oczywiście regeneracja, jak wszystko w życiu, działa dlatego, że się ma geny, które ją warunkują lub umożliwiałyby, gdyby je nieco dalej zmutować. Naukowcy z Yale, kierowani przez Craiga M. Crewsa, skorzystali z techniki zwanej CRISP-R/Cas9. Umożliwia ona celowaną i precyzyjną edycję genów. I znaleźli geny wprost odpowiedzialne za regenerację. Co jest nietrywialne, gdyż przypomina łowienie igły wręcz w stodole siana. Nasz ludzki genom w porównaniu z płazim to maleństwo, taki stóg. Do tych wszystkich zagadnień jeszcze po kolei wrócę.

Medycyna regeneracyjna – bo to historia o jej podstawach i perspektywach – daje nadzieję na leczenie wielu poważnych chorób. Choć badania nad tzw. komórkami macierzystymi trwają od wielu lat, to postęp w tej dziedzinie znacząco odbiega od rozbudzonych nadziei. Mimo to prywatne kliniki – z chęci zysku – oferują terapie komórkowe i genowe o niesprawdzonym działaniu. Takie nieetyczne praktyki niosą ryzyko dla pacjentów. Problem stał się przyczynkiem do specjalnego raportu europejskich akademii nauk.

Przeciwieństwo gojenia się

Płazy są przedziwne i pradawne, czyli gdyby nie one, to nas by tu nie było. To ich przodkom bowiem dosłownie wyrosły nogi (sic! – uwaga, o to właśnie chodzi w naszych rozważaniach), dzięki czemu wyszły z wody i podbiły lądy [2]. Po czym żyją z nami od niemal 400 milionów lat, czyli późnego dewonu, choć ostatnio niestety nie mają się najlepiej, wykańcza je bowiem pewien srogi zakaźny grzyb, o czym pisałam w tekście „My zjadamy je, one nas”.

Możemy dziś płazy spotkać w formie beznogiej – aczkolwiek to rzadkość, o której nie uczą nas w szkole [3]. Poza tym na świecie występuje znana każdemu klasyka: płazy ogoniaste – traszki, salamandry etc., oraz płazy bezogonowe, czyli żaby i ropuchy.

Zanim płazy z wyszły wody, jeszcze w rybiej powłoce zaczęły przekształcać swoje płetwy, co dało w efekcie ryby mięśniopłetwe. Znaczy organizmy mutowały, a matka ewolucja to selekcjonowała pozytywnie – może tak było łatwiej nie utonąć, gdy zbiorniki wodne okresowo przesychały i zabagniały się? Widocznie coś w takim przekształceniu płetw było korzystnego, skoro owa grupa kręgowców rozrastała się, rozgałęziała i nawet w swej „żywej skamieniałości”, czyli trzonopłetwej rybie zwanej latimerią, przetrwała do dziś [4].

Wracajmy do regeneracji. Jak sama nazwa wskazuje, ów proces polega na robieniu czegoś od nowa, odtworzeniu czegoś, co zostało utracone. Paradoksalnie, jest to przeciwieństwem zagojenia się. Gdy bowiem zagoimy ranę po uciętym palcu, to już nie ma możliwości, żeby tam coś odrosło. Nie ma też możliwości, by utracony organ przyszyć i rzecz całą „odtworzyć” chirurgicznie. Rana musi być świeża, a gojenie trzeba wręcz powstrzymać (np. kładąc utracony fragment na lodzie).

I to nie jest tak, że człowiek w ogóle nie jest do tego zdolny. Ciekawym przypadkiem są palce. W „The Canadian Medical Association Journal” z maja 1932 roku można znaleźć opis regeneracji amputowanego koniuszka palca osoby dorosłej – a konkretnie tzw. paliczka dalszego (czyli tego, na którym rośnie paznokieć), należącego do chirurga z Montreal General Hospital. Owa regeneracja zajęła mniej niż miesiąc i objęła tak kość, jak i tkanki miękkie, skórę i paznokieć. Natomiast badania prowadzone w latach 70. XX wieku pokazały, że jeśli taka amputacja przydarzy się dziecku do dziesiątego roku życia i jeśli nie zastosuje się rutynowej procedury zaszycia rany nadmiarem skóry, to ów koniec palca odrośnie. Będzie jednak pozbawiony linii papilarnych, za to wyposażony w paznokieć.

Na logikę: zregenerować narząd oznacza, że najpierw musiałoby się dać odtworzyć komórki, z których się składa. Komórki musiałyby się namnożyć. W naturze znamy powszechnie dwie sytuacje tego typu.

Pierwsza, to komórki nowotworowe. Zbuntowane przeciw organizmowi, nieśmiertelne, czyli zdolne do nieskończonej liczby podziałów, tracące swą tkankową specyficzność. Nie – z tej mąki chleba nie będzie i nikt nie chciałby odtwarzania ręki lub nogi z komórek rakowych, choć to do pomyślenia.

Komórki, które przeszły transformację nowotworową, tracą przy tym coś absolutnie niezbędnego do odtworzenia jakiejkolwiek struktury ciała: są pozbawione zahamowania kontaktowego. Oznacza to, że rosnąc, zawsze utworzą bezkształtną bryłę. Tymczasem każdy organ ma precyzyjny kształt, zaś w rozwoju, jeśli płodowi rośnie coś za dużo (a niczym płaz mamy na początku skrzela zewnętrzne czy błony między palcami), to specjalny proces programowanej śmierci komórek, czyli apoptozy, musi się z tym nadmiarem uporać. Co w efekcie daje nam m.in. pięć eleganckich, zdatnych do precyzyjnych czynności, palców i brak ogona.

Żeby nerki były jak włosy….

Druga sytuacja (jeśli pominiemy aksolotla) to komórki macierzyste. Pojawiające się właśnie podczas rozwoju zarodkowego i stanowiące o indywidualnym rozwoju, według planu, każdej z naszych tkanek i każdego z organów. Takie jakby komórki embrionalne [5]. W dorosłym organizmie każda tkanka utrzymuje na ogół pewną pulę komórek macierzystych, niezbędnych do własnego odtwarzania się.

Nie jest bowiem tajemnicą, że bez żadnej interwencji medycznej odrastają nam na przykład włosy, które wypadły, o ile nie stracimy bezpowrotnie komórek macierzystych ukrytych na dnie torebki włosowej. Albo nabłonek jelitowy, który po prostu w gigantycznym tempie się nam złuszcza i odradza. Tak, że statystycznie co miesiąc mamy praktycznie nowe jelito. Odtwarza się też oczywiście nasza krew, zatem kobiety podczas menstruacji nie wykrwawiają się na śmierć. Takoż i mężczyźni, którzy się zatną w palec, choć często robią wrażenie, że właśnie umierają i strasznie bledną. Spokojnie, żyć będą.

W 2005 roku za pieniądze na projekty Komisji Europejskiej uczeni z Karolinska Institute w Sztokholmie (ci od przyznawania medycznych Nobli), rękami swego przedstawiciela dr. Jonasa Friséna, wykazali metodą datowania DNA za pomocą węgla C14, że właściwie niemal wszystkie komórki naszego organizmu nie żyją dłużej niż 10 lat [6]. Dlatego nie ma zmiłuj – każda nasza kość statystycznie wymienia swe wszystkie komórki, jedną po drugiej, co 10 lat. Podobnie skóra, tylko ona robi to w dwa tygodnie.

Oczywiście o ile komórki nie zostaną zranione, bo wtedy odpowiedzią pod hasłem „ratuj się kto może” jest wytwarzanie blizny, a nie regeneracja. Jedynie komórki endometrium macicy i wątroby odpowiadają na zranienie raczej regeneracją niż zabliźnianiem (stąd np. miesiączki nie ustają po tej pierwszej). Tylko bardzo nieliczne komórki, zwłaszcza te w korze mózgowej, żyją z nami od narodzin do późnej śmierci, co zresztą jest jedną z przyczyn starzenia się organizmu, jako całości.

Da się zatem pozyskiwać komórki macierzyste z tkanek (to niełatwe, ale możliwe) oraz w laboratorium doprowadzać komórki już dojrzałe do „amnezji”, żeby stały się niczym te embrionalne, po czym rozwijały się w tkankę dość dowolnie wybraną już dziś przez uczonych. Teraz trzeba się nauczyć, jak to zrobić, żeby chciały rosnąć w trójwymiarowej przestrzeni, ale nie jak rak, tylko jak tkanka. Uporządkowanie, z poszanowaniem projektu, planu i stosownego czasu pojawiania się kolejnych płaszczyzn podziału, kolejnych różnicujących warstw etc.

Tu od dobrej dekady w ramach tzw. inżynierii tkankowej poszukuje się materiałów, które mogą stanowić molekularne rusztowanie dla komórek – aby dzieląc się, tworzyły tkanki. Innym nieco pomysłem jest wzięcie komórki w jakimś polimerowym żelu i „wydrukowanie” na specjalnej drukarce 3D tkanki czy nawet narządu. Jeszcze gdzie indziej – np. próbując uzyskać produkujące insulinę wysepki trzustkowe – trzeba, jak się okazuje, „po prostu” zmusić komórki igłą manipulacyjną do rośnięcia jedna na drugiej, a nie wyłącznie jedna obok drugiej. Wszystkie chwyty dozwolone. Ale…

To nie jest tak naprawdę cud regeneracji, bo owa tkanka (np. skóra), czy nawet fragment narządu (np. wątroba) rośnie na szalce w laboratorium, a potem się ją przeszczepia. Ergo, to jak z tymi przyszywanymi palcami: cudownie, że można je przyszyć, no ale przecież to nie jest tak, że wzięły i na miejscu odcięcia odrosły. A już zupełnie nie do pominięcia w tym kontekście jest fakt istnienia „rozlanych” po całym organizmie narządów, jak nowo odkryte interstitium,o którego przedziwnej strukturze i funkcjach już pisałam. Nie wiadomo, jak ta ich struktura i z czego miałaby się odtworzyć w uciętym organie.

Opowieść kapelusznika

U aksolotla jest jednak inaczej. Odcięte organy odrastają. I na pierwszy rzut oka owych kończyn nic zgoła nie różni od naszych, ludzkich. Kto uważał na biologii w liceum wie, że żabie kości przedramienne i podudzia są, w przeciwieństwie do naszych, niepodzielone oraz że puszka mózgowa jest otwarta, no ale trudno sobie wyobrazić, dlaczego to miałoby stwarzać jakąś drastyczną różnicę regeneracyjną. A może chodzi o to, że aksolotl to w istocie larwa, a nie osobnik dorosły?

Ambystoma meksykańska to bowiem przedziwny płaz ogoniasty, zdolny do rozmnażania płciowego także jako larwa. Znaczy: cały jest niedojrzały jeszcze, ale gonady ma już dojrzałe. A powiadają, że seks powinien być zarezerwowany dla dorosłych. I w naturze jest, wszelkie larwy są na ogół niezdolne do rozmnażania płciowego, a tu takie coś! Nazywa się owo coś neotenią.

Skąd wiemy, że to larwa? To, co u ludzi określa się powiedzeniem „ma mleko pod nosem”, u płazów objawia się skrzelami zewnętrznymi. Każdy przyzwoity dorosły płaz oddycha płucami (i przez wilgotną skórę), zaś jego larwa, taka np. kijanka, jeszcze skrzelami zewnętrznymi. Wprawdzie aksolotl w przeciwieństwie do młodej kijanki ma wszystkie cztery kończyny, ale wisi mu po bokach szyi takie coś pierzaste, czerwonawe, które mocno się rusza w wodzie. Skrzela. A zatem to larwa.

Rzecz sama, czyli neotenia, jest na zupełnie inną, długą i przeciekawą opowieść, bo i my – strunowce (czyli tak od lancetnika po człowieka) – jesteśmy neoteniczną larwą. Osobnik dojrzały, którego zdolna do rozmnażania płciowego larwa stała się prawdopodobnie naszym przodkiem, to szkarłupień. Czyli jakiś odległy ewolucyjnie, pradawny kuzyn jeżowca czy rozgwiazdy.

Tu jest zatem część odpowiedzi na pytanie: dlaczego, nie będąc larwą, nie regenerujemy. Bo komórki larwalne podzieliły się dotąd mniej razy, są młodsze i bliższe życiowo zarodkowym, niż komórki osobnika dorosłego. Z drugiej jednak strony, widać nawet na obrazku, że aksolotl to nie embrion. Gdyby nie kolory i te wiszące po bokach skrzela, to nie różni się jakoś dramatycznie zewnętrznie ani anatomicznie od osobnika dorosłego.

Nieco światła musi zatem rzucić już nie tylko klasyczne, ale wręcz kanoniczne doświadczenie Joachima Hämmerlinga z roku 1931, opisane chyba we wszystkich podręcznikach uniwersyteckich do biologii na świecie. Otóż jednokomórkowy glon morski o wdzięcznej nazwie rodzajowej Acetabularia ma formę sporego, bo wysokości 0,5-10 cm, niby-grzybka. Ma niby-korzonki, gdzie znajduje się jądro komórkowe wraz ze swym DNA (o którego strukturze i odpowiedzialności za dziedziczenie Hämmerling nie mógł wszak wiedzieć). Powyżej ma niby-łodyżkę, zaś na niej znajduje się niby-kapelusik. Ten kapelusik wygląda dość różnorodnie u różnych gatunków tego tzw. parasolowca.

Jeśli odciąć sam kapelusik, zostanie on szybko zregenerowany. Jeśli odciąć wraz z nim i łodyżkę, zajmie to więcej czasu, ale glon da radę i tu z regeneracją. Z samej łodyżki nic się nie zregeneruje. A jak do wypełnionego jądrem niby-korzonka gatunku o kapeluszu parasolowym dodać łodyżkę z gatunku o kapeluszu pierzastym, to zregeneruje oczywiście niby-kapelusz parasolowy, czyli taki, jakie jest jądro tej komórki. To jest opowieść o tym, że wszelka informacja rozwojowa – a więc i regeneracja – jest zaprogramowana w jądrze komórkowym.

Skoro zatem jądro decyduje, co się zregeneruje, to wszystko (albo całkiem sporo wszystkiego) znajduje się w rękach, czy raczej w helisie DNA. Im więcej DNA, tym teoretycznie więcej genów, tym większa plastyczność i tym więcej możliwości – w tym do regeneracji. Im zatem niżej na drabinie stworzenia dane zwierzę, im mniej – chciałoby się rzec – doskonałe (ale nie bądźmy lamarkistami i tak nie mówmy), tym mniej powinno mieć DNA, tym mniej plastyczności i możliwości.

Natura jednak lubi paradoksy i nie ma chyba gromady kręgowców, która gwarantowałaby większy ich zestaw niż płazy. Wśród owych paradoksów jest niebywała wielkość ich genomów. Gdy człowiek ma jakieś trzy miliardy par zasad DNA w pojedynczym komplecie chromosomów, to pierwszy z brzegu płaz ogoniasty potrafi ich mieć 50 miliardów. A co już zupełnie niewytłumaczalne, między dwoma gatunkami tego samego rodzaju różnica w liczbie owego DNA może wynosić 100 procent. Nie wynika stąd zatem jakaś gigantyczna różnica złożoności organizmu. O co zatem chodzi?

Odcięta goleń salamandry

Genów, czyli fragmentów DNA, które kodują jakiś produkt, mamy w obrębie grup taksonomicznych tyle samo. Jednak to nie jedyny DNA, jaki funkcjonuje w genomie. Reszta to takie z pozoru nieużywane, genetyczne bla, bla,bla, zapisane z czterech liter: A, G, C, T. Taki „bełkot”, zwany też inaczej „milczącym DNA”, to grubo ponad 50 proc. DNA człowieka, 30 proc. znacznie efektywniej upakowanego genomu muszki owocowej i ponad 90 proc. genomu płazów ogoniastych. Takie sekwencje mają bardzo wiele powtórzeń w genomie, nie są unikatowe, niczym większość genów. Co nie znaczy, że są zbędne. Tam są sekwencje regulujące pracę genów (tzw. enhancery i silencery, czyli wzmacniacze i wyciszacze transkrypcji informacji genetycznej) oraz różne inne odcinki, mające na konkretne zespoły genów wpływ, ale jakby z oddali.

Ostatnio w owym „milczącym DNA” – które, niczym Mojżesz, dużo mówi jak na „niewprawnego w mowie i niewprawnego w języku” – uczeni z Ontario Institute for Cancer Research pod kierunkiem dr. Jüri Reimanda zrobili katalog wszystkich mutacji skojarzonych z nowotworami. Jeśli taki kawałek DNA potrafi, zmutowawszy, wywołać raka, to znaczy, że jest w organizmie bardzo ważny. Właśnie dla podziałów komórek, regulacji wzrostu, programowanej śmierci zwanej apoptozą etc. Dla tych wszystkich cudownych elementów, z których składa się także regeneracja.

Nasz znajomy aksolotl ma więc na statystyczną głowę 10 razy więcej DNA od człowieka. Biolodzy rozwoju z Yale musieli zatem, w poszukiwaniu sekwencji związanych z regeneracją, naprawdę sprytnie i głęboko „zapuścić żurawia” w DNA tego płaza. Jak to bywa, gdy ludzie utalentowani i posiadający środki płatnicze napotkają nierozwiązywalny dotąd problem, usiedli i wymyślili nową metodę. W sumie to skleili dwie poprzednie: nowoczesne sekwencjonowanie DNA i technologię edycji genów, wspomniany CRISP-R/Cas9.

Bo czym innym jest zsekwencjonować nieco starszymi technologiami trzy miliardy par zasad DNA człowieka, gdzie wszyscy jesteśmy doprawdy do siebie podobni i co robi się już dziś rutynowo, a czym innym łowić kilka istotnych genów w niepoznanej w pełni i mającej gigantyczne rozmiary genetycznej zupie, pełnej powtórzonych sekwencji. Dotychczasowe technologie w obliczu powtarzającego się tysiąckrotnie zestawu „bełkotliwych” fragmentów DNA, stoją bezradne. A badania funkcjonalne (czyli zmutujemy gen i zobaczymy, co będzie) są wtedy bardzo utrudnione.

Nie ma to jednak, jak mieć zdolnego (do wszystkiego) doktoranta. To dziś w laboratoriach jest podstawowa siła robocza, a nawet intelektualna. Niedoceniana, bardzo kiepsko opłacana, pozbawiona ochrony związków zawodowych. Wyścig o osiągnięcia naukowe wygrywają „posiadacze” sporego, karnego, inteligentnego i nieznającego życia poza labem „parku” doktorantów. Jednym z takich doktorantów był Lucas Sanor z Yale. Obmyślił wieloetapowy proces oparty o CRISP-R/Cas9, pozwalający dołączyć specjalną molekularną etykietkę do 25 genów jeden po drugim. Co pozwalało śledzić ich aktywność.

Owe geny podejrzewane były o związek z regeneracją uciętej salamandrowej goleni. Sama salamandra świeciła na zielono, natomiast odrastająca nóżka świeciła na czerwono, albo nie. Aby uzyskać takie chimery, poświęcić trzeba było miesiące w labie dzień i noc. Gdy jednak znaczniki były już zaczepione i działały, analiza jest prosta i wystarczy lupa.

Gdy uciąć aksolotlowi cokolwiek, ale go nie zabijać (bez najmniejszej szkody dla tego stworzenia można tak potraktować jego kończyny, skrzela i ogon), na początku pojawia się blastema. To taka masa szybko dzielących się komórek. Są wśród nich komórki wyspecjalizowanych tkanek płaza, które zapomniały w wyniku urazu i wynikłych z tego zmian biochemicznych, kim są i że dzielić się już nie powinny. Oraz komórki macierzyste, w jakimś procencie zawsze rozsiane po tkankach, z wielką potencją do dzielenia się. Co nie zabija, to wzmacnia. W blastemie zachodzą procesy przypominające fragmentarycznie rozwój zarodkowy [7].

I dwa spośród śledzonych 25 genów okazują się na pewno aktywnie uczestniczyć w odrastaniu uciętej łapy aksolotla. Big news jest taki, że mają one swoje odpowiedniki w naszym, ludzkim genomie. Trzeba by tylko w przyszłości nauczyć się sterować ich aktywnością, i już. Droga do odrastania naszych kończyn, a nie tylko czubków palców, stanęłaby może otworem.

Oczywiście odrastanie nogi nie jest uwarunkowane jedynie przez dwa geny, ale lepiej znać dwa geny niż żadnego. Kolejny pracowity doktorant w Yale połowi w zupie DNA i złapie kolejne. A mózg? Jak można przeczytać w niniejszej publikacji z 2015 roku autorów z Niemiec [8], też się nieco odtworzy, trzeba by tylko, bagatelka, przestać oddychać. Wtedy w mózgu pojawią się wolne rodniki tlenowe i wymuszą regenerację. Przynajmniej tak to działa u traszek. Jeśli chcemy cudów regeneracji, musimy poszukać w sobie ukrytego płaza.

– Magdalena Kawalec-Segond, doktor nauk medycznych, biolog molekularny, mikrobiolog, współautorka „Słownika bakterii”, popularyzatorka nauki prowadząca stronę Naukovo.pl

TYGODNIK TVP, ul. Woronicza 17, 00-999 Warszawa. Redakcja i autorzy